Aceleração nanoplasmônica da amplificação de ácidos nucleicos para detecção de patógenos

Nature Nanotechnology volume 18, páginas 846–847 (2023)Cite este artigo

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Um sistema automatizado que acopla microfluídica com injeção plasmônica de elétrons quentes para acelerar a detecção colorimétrica de amplificação de DNA e RNA atinge 95% de precisão de detecção em amostras de saliva humana. Esta técnica utiliza diferentes ensaios de amplificação para identificação de patógenos e pode diferenciar variantes e subtipos virais.

Os longos protocolos envolvidos com ensaios baseados na detecção e replicação de ácidos nucleicos através de sondas de ácidos nucleicos (ensaios de amplificação) dificultam a detecção rápida de patógenos no ponto necessário, e muito menos a automatização do processo desde a preparação da amostra até o resultado1. Esta restrição dificulta a tomada de decisões relativamente à gestão da propagação de infecções respiratórias virais, que — devido à sua incidência crescente — afectam cada vez mais a população e a economia globais. Tais limitações foram particularmente destacadas nas fases iniciais da pandemia da COVID-19, quando houve um esforço mundial para desenvolver e utilizar testes de diagnóstico. Atualmente, os testes de antígeno são os testes de escolha para ambientes pontuais devido à sua operação simples e rápida. No entanto, os testes de antigénio têm menor sensibilidade do que os testes de reacção em cadeia da polimerase (PCR)2, dificultando a sua aplicabilidade para informar a tomada de decisões em matéria de cuidados de saúde no início da infecção.

Propomos uma técnica - QolorEX - para obter uma leitura colorimétrica quantitativa sem rótulo com resolução de nucleotídeo único, que pode obter um resultado em minutos. Esta abordagem integra ensaios colorimétricos de amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa baseada em vermelho de fenol (RT-LAMP) e amplificação de círculo rolante (RCA) com microfluídica de nanosuperfície plasmônica miniaturizada para obter catálise de ponto quente plasmônico . Para agilizar a reação de amplificação, desenvolvemos um cartucho microfluídico que utiliza atuação microfluídica ajustável dependente do ângulo para integrar o ciclo completo de coleta de amostras, lise, adição de reagentes de ensaio, amplificação de ácido nucleico e detecção (Fig. 1a). Para reduzir erros introduzidos pelo usuário, desenvolvemos uma caixa de imagem acoplada à iluminação com atuadores automatizados para manusear, aquecer e gerar imagens do cartucho microfluídico sem exigir a entrada do usuário. Essa automação permite que o usuário toque em um botão em um aplicativo de celular para iniciar a operação sequencial do cartucho microfluídico. A leitura colorimétrica é detectada automaticamente pela câmera complementar de semicondutor de óxido metálico (CMOS) integrada à caixa de imagem. Um algoritmo de aprendizado de máquina analisa a leitura e estabelece resultados positivos ou negativos; o resultado é então enviado para o celular do usuário.

a, Um esquema da operação do QolorEX. O usuário cospe saliva no funil de coleta e coloca o cartucho microfluídico dentro da caixa de imagem. Os resultados são retransmitidos automaticamente por meio de um aplicativo de smartphone. b, Após excitação luminosa, o nanomaterial plasmônico acelera o ensaio de amplificação devido ao excesso de elétrons na interface de reação. A taxa de amplificação aumentada aumenta a taxa de produção de prótons, que diminuem o pH do meio, fazendo com que o vermelho de fenol mude rapidamente de cor de fúcsia para amarelo na presença do patógeno alvo (mostrado na inserção). dNTP, trifosfato de desoxirribonucleotídeo; DOS, densidade de estados; E, energia; FE, energia de Fermi; ϕensaio, energia de início da reação de oxidação; ħω, energia do fóton; ΔV, volume da câmara de detecção. © 2023, AbdElFatah, T. et al.

Demonstramos que a leitura colorimétrica rápida obtida com QolorEX depende fortemente da injeção de elétrons 'quentes' excitados pela luz da superfície de nanopartículas plasmônicas automontadas na mistura de amostra e reagentes de ensaio na câmara de detecção. Esses elétrons quentes aceleram a reação nucleofílica na etapa de polimerização da amplificação, que por sua vez resulta na transformação da cor dependente do pH, livre de rótulo, do vermelho de fenol de fúcsia para amarelo (Fig. 1b). Descobrimos que superfícies plasmônicas com nanopartículas de 400 nm de diâmetro ofereceram maior aprimoramento do campo eletromagnético e efeitos associados de catálise de ponto quente plasmônico do que superfícies plasmônicas com outros tamanhos de nanopartículas, resultando em uma aceleração de 9 vezes na taxa de reação de amplificação em média.