A análise combinada do proteoma e do metaboloma fornece informações sobre o microRNA

Parasitas e Vetores volume 16, Número do artigo: 271 (2023) Citar este artigo

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Os vírus patogênicos podem ser transmitidos pelas fêmeas do mosquito Aedes aegypti (Ae. aegypti) durante a aquisição de repasto sanguíneo de vertebrados. O silenciamento do microRNA específico do mosquito e do intestino médio (miRNA) 1174 (miR-1174) prejudica a ingestão de sangue e aumenta a mortalidade. A determinação da identidade das proteínas e metabólitos que respondem à depleção do miR-1174 aumentará nossa compreensão dos mecanismos moleculares deste miRNA no controle da alimentação sanguínea e do metabolismo de nutrientes dos mosquitos.

Oligonucleotídeos antisense (antagomirs [Ant]) Ant-1174 e Ant-Ct foram injetados em fêmeas de Ae. mosquitos aegypti às 12-20 horas após o encerramento, e a depleção do miR-1174 foi confirmada por PCR quantitativo em tempo real com transcrição reversa (RT-qPCR). Mosquitos injetados e controle com Ant-1174 foram coletados antes da refeição de sangue às 72 horas pós-injeção para análise proteômica baseada em tag de massa em tandem e análise metabolômica não-alvo por cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem para identificar proteínas e metabólitos diferencialmente expressos, respectivamente. A interferência de RNA (RNAi) usando injeção de RNA de fita dupla (dsRNA) foi aplicada para investigar os papéis biológicos desses genes expressos diferencialmente. O efeito RNAi foi verificado por RT-qPCR e ensaios de western blotting. O conteúdo de triglicerídeos e os níveis de ATP foram medidos utilizando os kits de ensaio apropriados, seguindo as instruções do fabricante. As análises estatísticas foram realizadas com o software GraphPad7 utilizando o teste t de Student.

Após a depleção do miR-1174 específico do mosquito e do intestino médio, um total de 383 proteínas expressas diferencialmente (DEPs) foram identificadas, entre as quais 258 foram reguladas positivamente e 125 foram reguladas negativamente. A análise funcional desses DEPs usando o enriquecimento da Gene Ontology (GO) e da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) sugeriu que o miR-1174 desempenha papéis regulatórios importantes no metabolismo de aminoácidos, metabolismo de nucleotídeos, metabolismo de ácidos graxos e vias de metabolismo de açúcar. Foram identificados um total de 292 metabólitos diferenciais, dos quais 141 foram regulados positivamente e 151 foram regulados negativamente. A análise integrativa mostrou que as proteínas e metabólitos diferenciais associados foram enriquecidos principalmente em uma variedade de vias metabólicas, incluindo glicólise, ciclo do citrato, fosforilação oxidativa e metabolismo de aminoácidos. Especificamente, o gene de uma proteína regulada positivamente em mosquitos com depleção de miR-1174, a purina nucleosídeo fosforilase (PNP; AAEL002269), foi associada às vias metabólicas de purina, pirimidina e niacina-nicotinamida. O knockdown do PNP inibiu seriamente a digestão do sangue e o desenvolvimento dos ovários e aumentou a mortalidade de adultos. Mecanicamente, a depleção de PNP levou a uma regulação negativa significativa do gene da vitelogenina (Vg); além disso, alguns genes importantes nas vias de sinalização da ecdisona e de sinalização de peptídeos semelhantes à insulina relacionados ao desenvolvimento dos ovários foram afetados.

Este estudo demonstra acúmulo diferencial de proteínas e metabólitos em Ae com depleção de miR-1174. mosquitos aegypti usando técnicas proteômicas e metabolômicas. Os resultados fornecem evidências funcionais para o papel do gene PNP regulado positivamente nas atividades fisiológicas intestinais. Nossas descobertas destacam alterações moleculares importantes em Ae depletado de miR-1174. aegypti e, assim, fornecer uma base e novos insights para aumentar a compreensão do mecanismo molecular envolvido em um miRNA específico de linhagem em mosquitos vetores.

As fêmeas das espécies de mosquitos vetores retiram sangue de vertebrados para obter os aminoácidos e outros nutrientes necessários ao desenvolvimento dos ovos; conseqüentemente, servem como vetores de um grande número de patógenos virais. Com a urbanização global e o aquecimento contínuo do clima, o risco de doenças transmitidas por mosquitos está a aumentar em todo o mundo, representando um sério desafio para a saúde pública e impondo encargos económicos significativos a muitos países [1]. Nos últimos anos, uma série de estratégias e tecnologias promissoras para controlar mosquitos vetores baseadas na manipulação genética têm ganhado aceitação [2,3,4,5]. No entanto, a falta de intervenções médicas eficazes ainda restringe a prevenção e o controlo da maioria das doenças transmitidas por mosquitos.

1.2, as described in other studies [13,14,15,16] (Additional file 3: Table S3). The DEPs were subjected to GO enrichment [17] and KEGG pathway enrichment analyses [18]./p> 1 and P < 0.05 (unpaired two-sided Student’s t-tests) in the OPLS-DA model were considered to be differentially expressed metabolites (DEMs). Volcano plots and a hierarchically clustered heatmap were plotted to visualize significant features of the identified DEMs. Commercial databases, including KEGG (http://www.genome.jp/kegg/) and MetaboAnalyst 5.0 (http://www.metaboanalyst.ca/), were used for pathway enrichment analysis. Finally, integrated analysis of the proteome and metabolome was performed for the differential proteins and metabolites./p> 1.8 was considered to be satisfactory for subsequent experiments. The integrity of the extracted RNA was checked by 1% agarose gel electrophoresis. All primer pairs for the real time quantitative PCR (RT-qPCR) amplification of genes were designed using the software Primer Premier 5.0 and then synthesized at Sangon Biotech (Shanghai, China) (Additional file 7: Table S7). To examine the expression of the protein-coding genes, 1 µg of total RNA was reverse-transcribed into complementary DNA (cDNA) using the SuperScript™ IV First-Strand Synthesis System (TaKaRa Bio Inc., Otsu, Shiga, Japan). RT-qPCR was performed using TB Green Premix Ex Taq TM II (Tli RNaseH Plus; TaKaRa Bio Inc.). The reaction volume (20 µl) contained 10 µl of 2× NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus (Tiangen Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China), 0.8 µl of 10 µM primers, 0.4 µl ROX Dye II, 2 µl diluted cDNA and 6.8 µl ddH2O. Ribosomal protein S7 (RPS7; AAEL009496-RA) served as the internal control. Reactions were conducted on an ABI7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). The amplification procedure was: pretreatment at 95 °C for 1 min; followed by 40 cycles of 95 °C for 1 min and 60 °C for 1 min; ending with the generation of the dissolution curves at 95 °C for 15 s, 60 °C for 1 min and 95 °C for 15 s. To examine the expression level of miR-1174, 1 µg of total RNA was reverse-transcribed into cDNA using the SynScript® III miRNA RT SuperMix (TSK3001; Tsingke Biotechnology Co.,Ltd., Beijing, China). RT-qPCR was performed using a miRNA Universal SYBR qPCR Mix (TSE2001; Tsingke Biotechnology Co., Ltd.). The total reaction volume (20 µl) contained 10 µl of miRNA Universal SYBR qPCR Mix (Tsingke Biotechnology Co., Ltd.), 0.8 µl of 10 µM primers, 0.4 µl of 50× ROX Reference Dye II, 2 µl of diluted cDNA and 6.8 µl of ddH2O. Small nuclear RNA (snRNA) U6 (AAEL029000-RA) was used as the internal control. Reactions were conducted on the ABI7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) using the following amplification procedure: pretreatment at 95 °C for 1 min; followed by 40 cycles of 95 °C for 10 s and 60 °C for 30 s; ending with the generation of the dissolution curves at 95 °C for 15 s, 60 °C for 1 min and 95 °C for 15 s./p> 1.2, as used in other studies [13,14,15,16], we determined 383 DEPs, of which 258 were upregulated and 125 were downregulated (Fig. 1c; Additional file 8: Table S8). Hierarchical cluster analysis showed that these 383 DEPs were separated into upregulated and downregulated clades, and that the Ant-1174 group was differentiated from the control group (Fig. 1d); thus, miR-1174 depletion substantially caused a global protein expression response in mosquitoes./p> 1.2 or < 0.83, P < 0.05) illustrating the proteins differentially expressed between the Ant-1174 and control groups. The significantly upregulated differentially expressed proteins are shown in red, the significantly downregulated differentially expressed proteins are shown in blue and the proteins with no significant difference are shown in gray. d Hierarchical clustering analysis of the differentially expressed proteins visualized as a heatmap. The color blocks in different positions represent the relative expression of the corresponding proteins: red represents high expression and blue represents low expression. e Bubble chart showing GO enrichment of Ant-1174 vs Control. f KEGG pathways enriched by differentially expressed proteins between Ant-1174 and control group. Ant-1174/Ant-Ct, antisense oligonucleotides (antagomirs) Ant-1174/Ant-Ct; BP, biological Process; CC, cellular component; GO, Gene Ontology; KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; MF, molecular function; miRNA-1174, microRNA-1174; PIJ, postinjection; WT, wild type/p> 1 and P value (in a Student’s t-test) < 0.05 yielded 292 differential metabolites, of which 141 were upregulated and 151 were downregulated (Fig. 2d; Additional file 9: Table S9). Hierarchical clustering analysis of these differential metabolites showed that samples of the same group were clustered in one clade and those of different groups were separated from each other (Fig. 2e; Additional file 10: Table S10). The upregulated metabolites could be divided into 10 super classes, of which the top five were organic acids and their derivatives; lipids and lipid-like molecules; organoheterocyclic compounds; organic oxygen compounds; and benzenoids (Fig. 2f; Additional file 11: Table S11). The downregulated metabolites could be divided into 11 super classes, of which the top five were organic oxygen compounds; organic acids and derivatives; lipids and lipid-like molecules; organoheterocyclic compounds; and nucleosides, nucleotides and analogs (Fig. 2f; Additional file 11: Table S11). In the super class organic acids and derivatives, 41 metabolites (76%) of POS mode and 24 metabolites (69%) of NEG mode belonged to the subclass amino acids, peptides and analogs. In the super class organic oxygen compounds, eight metabolites (62%) of POS mode and 29 metabolites (81%) of NEG mode belonged to the subclass carbohydrates and carbohydrate conjugates. We then performed a KEGG pathway enrichment analysis of these DEMs (Fig. 2g; Additional file 12: Table S12), which revealed that the DEMs were mainly enriched in the pathway aminoacyl-tRNA biosynthesis, followed by purine metabolism, glycerophospholipid metabolism, galactose metabolism, pyrimidine metabolism, glycine, serine and threonine metabolism, arginine and proline metabolism, pentose and glucuronate interconversions, alanine, aspartate and glutamate metabolism, cysteine and methionine metabolism, lysine degradation, amino sugar and nucleotide sugar metabolism, sphingolipid metabolism and glyoxylate and dicarboxylate metabolism./p>